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该项研究所报道的III-A型CRISPR-Cas效应复合物结构组成为Csm1121324151:crRNA,复合物整体呈“长靴”状,Csm1位于靴底,Csm1的C端和Csm2各形成一个“helix
bundle”并结合在一起组成靴筒,Csm4、Csm3.1、Csm3.2以及Csm5依次从靴底盘旋而上,和靴筒形成类似于双螺旋的结构。研究人员构建了一条5’端和Csm4结合,并自Csm4起始,贯穿Csm3.1、Csm3.2以及Csm5的crRNA,其中Csm4、Csm3.1及Csm3.2特定的β-sheet依次使得crRNA的8、14和20位碱基发生了翻转,表明了其降解位点,并得到后续的生化实验验证。

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该系统如何通过特异性识别以防止误伤自身的RNA和DNA是人们关心的一个重要问题。生化研究表明,当target
RNA序列与crRNA
5’-handle互补时,Cas10的ssDNase活性会被抑制,从而保护宿主DNA免于被降解;而当来自于外源基因的target
RNA无法与crRNA
5’-handle互补配对时,则激活Cas10的ssDNase活性。然而,由于目前III-A型CRISPR-Cas效应复合物仅有几个低分辨率的电镜结构,所以对于III-A型CRISPR-Cas系统的若干问题,包括其效应复合物的组装形式,crRNA
5’-handle非互补target
RNA激活Csm1的ssDNA切割活性的结构基础以及促使腺苷酸环化的结构机制是什么等并不清楚。

III-A型CRISPR-Cas系统中Csm复合物的结构生物学研究。A. Csm-cognate target
RNA-AMPPNP复合物的电镜结构。B.
III-A型CRISPR-Cas系统抵御外源核酸入侵的模式图。

细菌和古菌中的CRISPR-Cas系统可以特异性识别并降解外源入侵的基因,目前有的系统已开发为最前沿的基因编辑工具。根据干扰机制的不同,CRISPR-Cas系统主要被分为六种类型。目前,人们对I、II、V和VI型CRISPR-Cas系统的结构和功能研究得较为详尽,而对其他类型的结构与功能了解相对较少。

王艳丽和章新政为该文的共同通讯作者。王艳丽组的尤李兰、王久宇及章新政组的马军为该文的共同第一作者,该研究得到科技部、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项、国家“青年千人计划”项目以及HHMI-Wellcome基金的资助,上海同步辐射光源、生物物理所生物成像中心和同位素实验室为该研究提供了技术支持。

图:III-A型CRISPR-Cas效应复合物的结构生物学研究。A,T.onnurineus中III-A型CRISPR-Cas效应复合物的冷冻电镜结构全貌;B,A图中效应复合物所对应的模式图;C,ToCsm1和2个ATP分子的晶体结构图;D,ToCsm1的表面电势图及预测的target
RNA结合通道,结合通道为图中虚线所示。

该项研究报道了嗜热链球菌(Streptococcus
thermophilus
)III-A型效应复合物Csm的高分辨率晶体结构,以及Csm与不同类型的目的RNA及ATP的七种不同底物结合状态的、近原子分辨率的冷冻电镜结构。研究表明Csm复合物由Csm1-5五种蛋白亚基和一条crRNA共同组成,并发现Csm复合物的组成将随着crRNA的长度变化而发生变化,但是5种Csm蛋白的组成一直遵循Csm112n3n+14151的规律。该研究选取了3’互补以及非互补的目的RNA,发现目的RNA与crRNA在位是否互补配对是激活Csm1切割ssDNA以及合成cOA的关键因素。而且,研究发现3’非互补的目的RNA的结合导致Csm1局部区域的构象变化,从而通过别构效应激活Csm1的DNA酶和腺苷酸环化酶的活性。该研究是CRISPR-Cas系统抗病毒机理的又一重大突破,进一步阐明多蛋白组成的效应复合物识别和切割外源核酸的分子机制,并为开发III型CRISPR系统作为应用工具打下重要的理论基础。

此外,研究人员还解析了ToCsm1和2个ATP分子1.69埃分辨率的晶体结构,揭示了环化酶结合ATP分子的预反应状态。通过和其他相关结构的比较,发现ToCsm1的若干结构域的构象变化在宿主保护自我以及激活ToCsm复合物的ssDNA切割活性方面起重要作用。

11月29日,《细胞》(Cell)杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组和章新政课题组合作的研究论文“Structure
Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional
Interference
”。该工作解析了不同状态的III-A型CRISPR-Cas系统效应复合物Csm的结构,并结合体内和体外的功能实验,系统地阐述了III型CRISPR-Cas系统抵御外源核酸的分子机制。王艳丽课题组一直致力于CRISPR-Cas系统抗病毒作用机理的研究,前期研究揭示了CRISPR-Cas系统的重要作用机理(Nature
2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol.
Cell
2017),这也是王艳丽组和章新政组长期合作 (Cell Res 2016, Cell
2017b)取得的另一重要进展。

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